技術簡介

pUC18是一種由pBR322改造而來的質(zhì)粒載體，全長2686bp。在質(zhì)粒的多克隆位點（MCS)上下游含有M13正向和反向引物結(jié)合位點，以便于對插入的DNA片段進行常規(guī)測序。本方法采取同源重組的策略代替?zhèn)鹘y(tǒng)的TA克隆，實現(xiàn)對任何PCR片段的快速克隆。

質(zhì)粒圖譜

克隆位點

PCR產(chǎn)物插入位點（SalI/XbaI）：

構(gòu)建流程

一、注冊登錄

1. 登錄SMART載體快速構(gòu)建系統(tǒng)地址：http://49.234.53.21/login（僅PC端使用）；

2. 點擊登錄框新用戶注冊，填寫紅色*必填項，點擊注冊即完成注冊。

二、訂單預填

1. 進入“我的訂單”，點擊右側(cè)的“新增”按鈕，進入新增訂單界面。在此界面可以查詢所有快構(gòu)載體信息、訂單預填或者提交訂單。

2. 在“載體名稱”處選擇目標載體（支持模糊查詢：隨著輸入字符的增加，縮小待選范圍）。

3. 下拉框選擇填入“CAB04-pUC18-PCR產(chǎn)物快速克隆”，然后在“上游位點”選擇填入SalI位點，在“下游位點”選擇填入XbaI位點。

4. 在“樣品名稱”里輸入5個字符（為了避免和其他客戶樣品混淆，字母和數(shù)字組合使用），并將此名稱命名在寄送的已純化的PCR產(chǎn)物管子上。

5. 在“插入片段”里填入預估的插入片段DNA堿基數(shù)。

6. “是否已經(jīng)純化”：是：強烈建議提供已經(jīng)電泳切膠純化后的、不低于20ul的含指定同源臂的PCR產(chǎn)物（未純化的樣品在運輸和后續(xù)操作過程中有可能出現(xiàn)降解等意外情況）。否：提供含同源臂的PCR原液100ul或電泳切膠后含單一目標條帶的膠塊，另收10元/樣的純化費。

7. “陽性克隆數(shù)”：客戶提交訂單時可以填寫一次性測序多少個陽性克隆，轉(zhuǎn)導生物也會根據(jù)實際提供的陽性克隆數(shù)進行更改。

8. “插入片段序列”： 在轉(zhuǎn)導測序的訂單需要粘貼待插入的整個目標序列（連同預計的同源臂及兩端額外5-10個堿基），用于測序結(jié)果分析比對；在第三方測序的，可以不粘貼序列，隨便輸入一個字符代替。

9. 點擊右下方的“保存”按鈕。此訂單的相應數(shù)據(jù)將作為草稿保存。如果后續(xù)需要修改此訂單，可以點擊“編輯”進行更改。

三、準備待待克隆的PCR片段

A. 分別在用于擴增的正反引物的5’端直接加上同源臂序列(直接復制粘貼無需反向互補)：5'TTGCATGCCTGCAGGTCGAC和5'GTACCCGGGGATCCTCTAGA。

    如下：ABC01F: TTGCATGCCTGCAGGTCGACTTNNNNNNNNNNNNNNNNN

             ABC01R: GTACCCGGGGATCCTCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNN

             N代表用于特異擴增的特異引物序列。

A. 盡量使用優(yōu)質(zhì)的高保真酶擴增目標片段（為了減小堿基突變概率，盡量不用含有Taq酶的PCR酶）。（客戶自主完成）；

B. 瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，并切膠目標條帶后純化回收。如果條帶比較弱，建議多做幾個體系的PCR產(chǎn)物，純化回收時用少量水反復過柱濃縮。

C. 已經(jīng)純化好的PCR樣品準備好后，通知收樣員收樣。

D. 在“我的訂單”向右橫向拖拉直至看到“代理/收樣員”。直接電話聯(lián)系收樣員（沒有收樣員的地區(qū)請低溫快遞至指定地址，拒絕到付件）。

四、克隆及測序

1. 樣品送出后，在“我的訂單”頁面找到相應訂單，點擊目標訂單最右側(cè)的“編輯”按鈕，提交處于保存狀態(tài)的訂單。（注意：A.如果是新客戶，客戶信息在還沒有通過審核的情況下，訂單提交功能還沒有開通，請及時聯(lián)系轉(zhuǎn)導生物工作人員；B.一旦提交訂單，客戶將不能修改此訂單，如果需要修改調(diào)整，請通過官方QQ4000275066聯(lián)系工作人員）。

2. 轉(zhuǎn)導生物在收到樣品的2個工作日內(nèi)完成克隆構(gòu)建實驗，并進入下游的測序環(huán)節(jié)。

3. 在轉(zhuǎn)導測序的訂單：提供陽性克隆甘油菌一份+小提保種質(zhì)粒一份，收基礎構(gòu)建費用+40元/測序反應+特異測序引物合成費用（5毛/堿基）；轉(zhuǎn)導生物還負責測序數(shù)據(jù)的整理、比對和結(jié)果展示。

4. 指定第三方公司（武漢奧科鼎盛）測序的訂單：僅提供陽性克隆甘油菌一份，收基礎構(gòu)建費用+10元/測序反應+特異測序引物合成費用（5毛/堿基）；構(gòu)建成功后，直接交由第三方測序公司完成1個通用引物測序，并發(fā)送至客戶郵箱，客戶審視結(jié)果后，如需加測請客戶自行郵件溝通；根據(jù)實測反應數(shù)（10元/反應）和加測引物堿基數(shù)（0.5元/bp），轉(zhuǎn)導直接收取相應費用，客戶不需要向第三方測序公司支付。

五、結(jié)算和交付

1. 測序完成后，客戶審視實驗結(jié)果。確定無誤后，轉(zhuǎn)導生物根據(jù)實際測序反應數(shù)和加測引物堿基數(shù)（通過訂單詳情頁可查看），再次核算結(jié)算金額并核銷收取相應費用。

2. 結(jié)算完成，請通過官方QQ400027506通知交付相應的陽性克隆甘油菌1ml（轉(zhuǎn)導測序的訂單還另含對應的一份小提質(zhì)粒）。