一、注冊登錄

1. 登錄SMART載體快速構(gòu)建系統(tǒng)地址：http://49.234.53.21/login  僅PC端使用）；

2. 點擊登錄框新用戶注冊，填寫紅色*必填項，點擊注冊即完成注冊。

二、訂單預(yù)填

1. 進(jìn)入“我的訂單”，點擊右側(cè)的“新增”按鈕，進(jìn)入新增訂單界面。在此界面可以查詢所有快構(gòu)載體信息、訂單預(yù)填或者提交訂單。

2. 在“載體名稱”處選擇目標(biāo)載體（支持模糊查詢：隨著輸入字符的增加，縮小待選范圍）。比如需要將目標(biāo)片段構(gòu)建到pEGFP-N1載體的HindIII/ApaI酶切位點之間。可以只輸入egfp，然后在下拉框選擇填入“AK162-pEGFP-N1-120元”。

3. 也可以精確輸入載體名稱，然后選擇填入“載體名稱”框，通過右側(cè)的綠色按鈕“查看載體詳情”進(jìn)入轉(zhuǎn)導(dǎo)生物官網(wǎng)查看相應(yīng)載體的全序列和圖譜。第一次使用某載體時，一定要仔細(xì)查看相應(yīng)信息，并確定是否為目標(biāo)載體。

4. 注意此載體有兩個不同的編號【代表此載體有兩處常用構(gòu)建位置（有個別載體甚至有3個以上的常用位置）】，可以首先選擇其中一個填入。

5. 盡管此編號載體“上游位點”有HindIII位點，但是“下游位點”的下拉框里面沒有ApaI位點選擇。這種情況可以繼續(xù)查看此載體是否有另外編號。如果仍然沒有其他編號含有目標(biāo)酶切位點，請更改方案或者選擇另外的酶切位點。

6. 下拉框選擇填入“AK162-pEGFP-N1-120元”，然后在“上游位點”選擇填入HindIII位點，在“下游位點”選擇填入ApaI位點。

7. 在“樣品名稱”里輸入5個字符（為了避免和其他客戶樣品混淆，字母和數(shù)字組合使用），并將此名稱命名在寄送的已純化的PCR產(chǎn)物管子上。

8. 在“插入片段”里填入預(yù)估的插入片段DNA堿基數(shù)。

9. “是否已經(jīng)純化”：是：強烈建議提供已經(jīng)電泳切膠純化后的、不低于20ul的含指定同源臂的PCR產(chǎn)物（未純化的樣品在運輸和后續(xù)操作過程中有可能出現(xiàn)降解等意外情況）。否：提供含同源臂的PCR原液100ul或電泳切膠后含單一目標(biāo)條帶的膠塊，另收10元/樣的純化費。

10. “陽性克隆數(shù)”：客戶提交訂單時可以填寫一次性測序多少個陽性克隆，轉(zhuǎn)導(dǎo)生物也會根據(jù)實際提供的陽性克隆數(shù)進(jìn)行更改。

11. “插入片段序列”： 在轉(zhuǎn)導(dǎo)測序的訂單需要粘貼待插入的整個目標(biāo)序列（連同預(yù)計的同源臂及兩端額外5-10個堿基），用于測序結(jié)果分析比對；在第三方測序的，可以不黏貼序列，隨便輸入一個字符代替。粘貼

12. 點擊右下方的“保存”按鈕。此訂單的相應(yīng)數(shù)據(jù)將作為草稿保存。如果后續(xù)需要修改此訂單，可以點擊“編輯”進(jìn)行更改。

三、準(zhǔn)備待構(gòu)建的PCR片段

1. 設(shè)計引物、合成后用于擴增目標(biāo)DNA片段：

A. 登錄系統(tǒng)，在“我的訂單”頁面找到相應(yīng)訂單。點擊目標(biāo)訂單最右側(cè)的“查看”按鈕。

B.在“上游位點”框里復(fù)制正向引物的同源臂序列，在“下游位點”框里復(fù)制反向引物的同源臂序列，。

C．將上游位點的同源臂序列直接粘貼在正向擴增引物的5’端。將下游位點的同源臂序列直接黏貼（無需再次反向互補）在反向擴增引物的5’端。

     如下：AB001F:CGGACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTNNNNNNNNNNNNNNNNN

              AB001R: GGTGGCGACCGGTGGATCCCGGGCCCNNNNNNNNNNNNNNNNN

              N代表用于特異擴增的特異引物序列。

D.含有指定同源臂序列的引物合成后，盡量使用優(yōu)質(zhì)的高保真酶擴增目標(biāo)片段（為了減小堿基突變概率，盡量不用含有Taq酶的PCR酶）。

E.瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，并切膠目標(biāo)條帶后進(jìn)行純化回收。如果條帶比較弱，建議多做幾個體系的PCR產(chǎn)物，純化回收時用少量水反復(fù)過柱濃縮。

2. 已經(jīng)純化好的PCR樣品準(zhǔn)備好后，通知收樣員收樣

3. 在“我的訂單”向右橫向拖拉直至看到“代理/收樣員”。直接電話聯(lián)系收樣員（沒有收樣員的地區(qū)請低溫快遞至指定地址，拒絕到付件）。

四、構(gòu)建及測序

1. 樣品送出后，在“我的訂單”頁面找到相應(yīng)訂單，點擊目標(biāo)訂單最右側(cè)的“編輯”按鈕，提交處于保存狀態(tài)的訂單。（注意：A.如果是新客戶，客戶信息在還沒有通過審核的情況下，訂單提交功能還沒有開通，請及時聯(lián)系轉(zhuǎn)導(dǎo)生物工作人員；B.一旦提交訂單，客戶將不能修改此訂單，如果需要修改調(diào)整，請通過官方QQ4000275066聯(lián)系工作人員）。

2. 轉(zhuǎn)導(dǎo)生物在收到樣品的2個工作日內(nèi)完成克隆構(gòu)建實驗，并進(jìn)入下游的測序環(huán)節(jié)。

3. 在轉(zhuǎn)導(dǎo)測序的訂單【省心模式（半包）】：提供陽性克隆甘油菌一份+小提保種質(zhì)粒一份，收基礎(chǔ)構(gòu)建費用+40元/測序反應(yīng)+特異測序引物合成費用（5毛/堿基）；轉(zhuǎn)導(dǎo)生物還負(fù)責(zé)測序數(shù)據(jù)的整理、比對和結(jié)果展示。

4. 指定第三方公司（武漢奧科鼎盛）測序的訂單【省錢模式（關(guān)鍵包）】：僅提供陽性克隆甘油菌一份，收基礎(chǔ)構(gòu)建費用+10元/測序反應(yīng)+特異測序引物合成費用（5毛/堿基）；構(gòu)建成功后，直接交由第三方測序公司完成1個通用引物測序，并發(fā)送至客戶郵箱，客戶審視結(jié)果后，如需加測請客戶自行郵件溝通；根據(jù)實測反應(yīng)數(shù)（10元/反應(yīng)）和加測引物堿基數(shù)（0.5元/bp），轉(zhuǎn)導(dǎo)直接收取相應(yīng)費用，客戶不需要向第三方測序公司支付。

五、結(jié)算和交付

1. 測序完成后，客戶審視實驗結(jié)果。確定無誤后，轉(zhuǎn)導(dǎo)生物根據(jù)實際測序反應(yīng)數(shù)和加測引物堿基數(shù)（通過訂單詳情頁可查看），再次核算結(jié)算金額并核銷收取相應(yīng)費用。

2. 結(jié)算完成，請通過官方QQ400027506通知交付相應(yīng)的陽性克隆甘油菌1ml（轉(zhuǎn)導(dǎo)測序的訂單還另含對應(yīng)的一份小提質(zhì)粒）。